溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui為關鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。
溫育這一步是ELISA測定中zui容易出現問題的步驟。通常目前國內ELISA試劑盒的反應溫育時間為37℃ 30分鐘～1小時，進口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2小時才能有較*的結合，低于1小時，可能會影響測定下限。要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間。一般來說，加完樣本和/或反應試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃，需要一定的時間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態下，這段升溫時間可能還比較長，而在實驗室中，很少有人注意這個問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。
    除有的ELISA試劑盒儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA檢測試劑盒板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。
    若用保溫箱，試劑盒應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA試劑盒板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。ELISA檢測試劑盒屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。ELISA試劑盒以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。
    這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標準室溫溫度是指20～25℃，但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，試劑盒只要平置于操作臺上即可。ELISA檢測試劑盒應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。為保證這一點，在一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。